当涂料防腐遇到生物技术

水性涂料已经成为杀菌剂制造商的重要市场。但是，随着法律对可使用的杀菌剂种类和量的控制越来越严格，涂料产品防腐变得更加具有挑战性。这包括对甲醛释放剂、对异噻唑啉酮，以及对重金属（例如铬）在涂料产品中的含量限制越来越苛刻。使用这些产品的公司一直在努力寻找符合新法规的方法，同时还要向其客户提供优质的无微生物产品。涂料行业对传统杀菌剂的关注，导致业界始终认为不会有新的活性剂出现，但是生物基添加剂提供了扭转这一趋势的解决方案。如果仅使用生物添加剂不足以消除所有微生物污染，则可以协同使用它们，以降低所需传统杀菌剂的量。通过应用生物技术和分子生物学方法，可以进一步降低使用量。此外，通过利用这些安全有效的生物添加剂的潜力，制造商可以扩展到他们可能尚未考虑的市场。本文介绍了生物技术在涂料防腐中的应用，以实现减少或消除传统杀菌剂的使用这一目标。

在过去的几十年中，因为溶剂型涂料的比例不断减少，以及市场对低VOC涂料需求的增长，水性涂料已成为杀菌剂制造商的一个有利可图的市场。随之而来的是，越来越多水基系统中的微生物污染和腐败急需控制，因为这些水性环境和有机营养源提供了非常适合微生物生长的环境。然而，关于所使用的杀菌剂的健康问题，以及对传统杀菌剂类型和浓度的限制日益严格制，对开发新型和低毒性防腐剂的需求日益增强。

不同的微生物类群对涂料性能会产生不同的负面影响。由于这个原因，常规杀菌剂根据其在液态罐内和干膜产品中的使用而有所不同。控制细菌对于罐内保存更加重要，而真菌和藻类则是干膜的最大威胁。在考虑使用防污系统时，微生物和大型底栖动物都要考虑到。在水性体系中，微生物的生长会水解组分，降低pH值，产生气体、恶臭，使薄膜内的产品变色并降低粘度，从而影响涂层质量。

被批准可用于罐内保存的传统杀菌剂通常包括甲醛释放剂、异噻唑啉酮衍生物以及溴化和其他卤化化合物。这些通常与诸如氨基甲酸酯、季胺、苯基脲衍生物和重金属之类结合使用，以保持干膜的保存和防污性能。杀菌活性的机制各不相同，包括由于烷基化剂、交联剂、亲电物质、膜破坏剂以及自由基和活性氧的释放剂所引起的影响。其中一些对人类有直接的影响（例如烷基化剂和交联剂），另一些如异噻唑啉酮类对人类的直接毒性较低，但在持续接触后可能引起过敏。这些及其他健康风险以及潜在的环境影响促使许多国家限制其含量和使用（或需要特殊标签）。

                                                                                     表1. 常用传统杀菌剂的实例

表1列出了一些常见的传统杀菌剂。许多罐内防腐剂均包含2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MIT）或其异噻唑啉酮衍生物之一，构成了诸如Kathon1.5和Rocima之类的品牌产品，法规对所有这些成份的使用和用量的限制在不断的严格化。从对甲醛释放剂和皮肤增敏剂的健康担忧，到继欧洲标准提高后（例如REACH和2013年的EUBiocides法规BPR法案）美国的反应，以及有人一直呼吁避免在建筑产品中完全使用杀菌剂，这些因素持续续给行业带来压力。为解决这些日益严峻的监管难题，但同时仍要为水性涂料提供所需的保护，需要新颖的方法出现。

生物基分子的例子包括如溶菌酶和葡萄糖氧化酶之类的酶，活性与天然抗菌肽比如防御素相似但分子量较小的小肽，甚至是含有此类分子的整个细胞。可以在液体和干膜包衣系统中通过保留这些分子的自然生物学功能实现直接抗菌或是与传统杀菌剂的协同抗菌。

本文描述了使用快速分子技术来选择生物分子实现安全有效地控制微生物污染，并且这些生物分子还可以与现有杀菌剂协同使用，来降低此类传统杀菌剂的用量。

分子技术在筛选生物基添加剂作为罐内防腐剂中的应用

我们根据抗菌特性，从肽库中选择出了长度为6-7个氨基酸（分子量低于1000g/mol）的小肽AMP-6和AMP-7。该数据库是使用组合合成方法创建的，可产生超过5300万种可能的肽，能够针对特定的抗菌活性进行筛选。

图1A. 肽组合数据库和抗菌活性。迭代氨基酸取代和相关的对镰刀菌的最低抑菌浓度（MIC）。

图1A显示了用于生成数据库的迭代氨基酸替代过程的示例以及针对常见丝状真菌镰刀菌的最小抑制剂浓度（MIC）。通过改变肽序列，可以“调节”针对特定目标微生物群的活性，例如对细菌对真菌和霉菌。使用组合化学方法，随着肽化学结构变得更加明确（在这种情况下为6个氨基酸链），杀死同一靶标微生物所需的浓度逐渐降低。在AMP-6（6-氨基酸肽）的情况下，对真菌的活性（由较低的MIC数表示）比所测试的细菌（需要更高的浓度）更高。仅添加一个氨基酸，AMP-7就对细菌和真菌均显示出令人满意的活性（图1B）。

图1B. 两种肽AMP-6和AMP-7之间的抗菌活性差异。数字表示针对所测试细菌和真菌的MIC。

◆分子生物学技术将测试时间缩短至数分钟而不是数周

使用基于分子的微生物生存力分析（例如XTT分析）可以快速评估候选抗微生物剂的作用。17XTT是四唑鎓染料（2,3-双-（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-2H-四唑鎓-5-羧苯胺）被代谢活跃细胞还原为有色产物（较暗的红棕色孔），与经过热杀死或用乙醇处理的细胞相比，这些细胞仍保持较浅的黄色（图2A）。可以使用分光光度计测量吸收光谱的差异，并快速评估细胞群体的生存能力。应用这些检测方法，有可能筛选抗微生物对特定污染微生物的选择性，而不是使用具有广泛毒性的杀菌剂。

图2A. 使用XTT活力测定法筛选生物添加剂，XTT通过活细胞生产可量化的甲䐶衍生物。

图2B显示，控制假单胞菌的不同污染菌株所需的生物添加剂的浓度可能会发生巨大变化。对于恶臭假单胞菌，几种药物在各种浓度下均有效（如新陈代谢的降低百分比更高），而铜绿假单胞菌则需要更高浓度的测试生物添加剂（蓝条）。

图2B-1. 生物添加剂对铜绿假单胞菌的假单胞菌的抗菌活性。更高的代谢减少百分比等于更高的功效。

图2B-2. 生物添加剂对恶臭假单胞菌的假单胞菌的抗菌活性。更高的代谢减少百分比等于更高的功效。

与现有传统杀菌剂的协同活性

根据最初的XTT筛选结果，评估了两种常见的杀菌剂与这些生物基药剂的协同活性：异噻唑啉酮（MIT）和甲醛释放剂1,3-二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲（DMDM）（图3）。

图3. 与传统杀菌剂MIT和DMDM结合使用时，对所选生物添加剂的抗微生物活性的评估。 蓝色条表示未添加传统杀生物剂，橙色条表示添加了15 ppm DMDM，黄色条表示添加了15 ppm MIT和指定浓度的葡萄 糖氧化酶或AMP-7。

用于评估生物添加剂和杀菌剂的是六种常见的细菌变质剂的混合接种测试板，包括几种假单胞菌和其他革兰氏阴性菌（如肠杆菌和革兰氏阳性芽孢杆菌）。在第一栏中，这些试剂在15ppm时才有效（15ppm是标记为皮肤敏化剂的临界值也是更严格的EUH208“可能产生过敏反应”的规定值）。在这次分析中，当浓度为15ppm时，几乎没有抑制作用（新陈代谢仅降低了约15％），但是当与特定的生物基添加剂结合使用时，效果会有所提高（从15％到超过70％，这与在热灭活的细胞中观察到的相当）。特别是具有葡萄糖氧化酶的协同活性，可以达到15ppm的有效杀灭率。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化和随后释放的过氧化氢，会引起细胞损伤。葡萄糖氧化酶被美国食品药品管理局（FDA）列为各种预期用途的公认安全（GRAS），在食品工业中经常使用。它以商业规模生产，并且可以批量购买。通过在XTT分析中测试各种浓度的葡萄糖氧化酶和MIT证实了这种明显的协同活性。

图4A. 葡萄糖氧化酶和MIT组合的生长抑制和协同分 析。显示了不同浓度的葡萄糖氧化酶和MIT的组合的响应（以生长抑制百分数表示）的热图。

测试板上细菌对葡萄糖氧化酶和MIT各种组合的反应显示如图4A所示，该图用颜色表达响应度，红色是生长抑制率最高，绿色是生长抑制率最低。为了测试这两种化合物之间是否存在拮抗作用或协同作用，通过零相互作用力（ZIP）方法，将葡萄糖氧化酶和MIT组合的响应用于确定协同作用得分，基于实际响应与预期响应的偏差得到评估分数。

图4B. 葡萄糖氧化酶和MIT组合的协同作用得分的等高线图，其中正得分（红色）表示协同作用，负得分（绿色）表示拮抗作用，零得分（白色）表示累加反 应。

在等高线图中以可视化方式显示每个组合（图4B）的得分，结果表明两种抗菌素通常以协同方式相互作用。葡萄糖氧化酶的浓度在50~500ppm之间，而MIT的浓度在0.15~1ppm以下时，存在协同作用区域，葡萄糖氧化酶浓度在10~1,000ppm之间以及MIT浓度在7~15ppm以下范围内时可以看到最大的协同作用。这表明葡萄糖氧化酶和MIT在低浓度和高浓度下都可以相互补充，从而达到降低MIT的水平并且显示有效的抗菌活性的目的。

使用ASTMD2574评估传统杀菌剂和葡萄糖氧化酶的协同作用

使用快速分子技术检测葡萄糖氧化酶的抗菌活性，使用传统的测试方法ASTMD2574油漆腐败标准进一步测试作为罐装涂料防腐剂的防腐性能。通过使用上述分子方法快速筛选目标微生物，选择经典测试（例如ASTMD2574），挑中最有希望的候选对象。

图5. 第七天 ASTM D2574 结果的示例照 片。

使用不含杀菌剂的丙烯酸胶乳（请参阅附录-配制材料和方法），使用和XTT分析使用的防腐败剂测试板一样的测试板；在七天内对样品进行监测。用于ASTMD2574的所选葡萄糖氧化酶剂量基于XTT分析的结果，其中50ppm显示与MIT和DMDM协同作用，而5ppm仅与DMDM协同作用。图5显示了最后一天的生物基添加剂和传统杀菌剂的测试板。在为期7天的监测期内，无杀菌剂的乳胶样品每天得分均为4（完全过度生长）。

             表2. ASTM D2547不含杀菌剂的丙烯酸乳胶的挑战结果

推荐剂量的MIT和DMDM在第1天评分达到了0（无增长），而较低的15ppm剂量DMDM的效果较差，在第7天仍显示4，MIT在第5天仍未达到0。但是，在使用不含杀菌剂的胶乳的ASTM方法中，最低的葡萄糖氧化酶测试浓度（50ppm）在第1天达到了0，而与15ppm的MIT或DMDM结合使用时，在第1天也达到了0（表2）。

虽然单独使用葡萄糖氧化酶显示出如此高的活性是一个积极的结果，但为了表征在丙烯酸乳胶中与传统杀菌剂的任

检测和消除油漆变质剂的分子方法

虽然像ASTMD2574这样的经典测试方法可以确定杀死所有挑战性生物的广谱抗毒性试剂，他们无法选择性地鉴定出对特定菌株有效的药物。通过使用DNA测序方法，可以特异性地识别哪些细菌被特定的生物基添加剂杀死以进行精确处理（图6A）。

图6A. 使用聚合酶链反应（PCR）和测序对腐败微生物进行分子检测。 测序结果与目测观察结果的比较。

实时定量聚合酶链反应（PCR）用于直接分析涂料中的微生物污染并鉴定特定污染物。图6B显示了使用选择性探针鉴定特定细菌种类的结果。当菌株特异性探针成功扩增靶DNA，荧光明显增加。这方法也可以用于确定污染水平。

图6B. 使用实时定量 PCR检测特定微生物和污染水平。

图6C显示了使用肠杆菌的剂量反应曲线，显示了在不同浓度下扩增所需要的循环次数的变化。通过确定细菌污染的具体水平并进行相应的处理，减少了在产品中使用高剂量的广谱毒性杀菌剂的需求。

图6C. 使用肠杆菌的剂量反应曲线。

使用基于生物的添加剂扩大市场：食品安全和对抗抗生素耐药性

使用一些具有多种应用GRAS认证的低毒性生物基添加剂，制造商可以拓展罐装涂料防腐剂以外的新市场——例如食品包装。基于抑制琼脂平板上微生物菌落形成的快速筛选技术被用于寻找抗大肠杆菌的活性剂以及探索活性剂之间的任何潜在协同作用。

图7A显示了涂有聚乙烯醇（PVA）的2.5厘米聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）小切口的图像，该切口掺入了用于测试琼脂平板上污染物抑制（在此情况下为大肠杆菌）的生物添加剂。随着每种药物浓度的增加，观察到生长受到抑制，可以通过塑料下可见菌落数量的减少来衡量。通过将两种试剂结合，可以进一步降低所需的每种试剂的浓度。

图7A. 用于筛选食品包装生物添加剂的方 法。接触带涂层的圆盘后大肠杆菌的生长（如细菌菌落所 示）。与具有增加的 AMP-7或壳聚糖浓度的涂层圆盘接触后， 大肠杆菌的生长（如 细菌菌落所示）。涂 膜盘下方的透明区域表示缺乏细菌生长。

根据这些结果，使用食品模拟肉饼（带有细胞生长颜色指示剂的微生物生长培养基）进行了实验室规模的测试，可以用测试微生物对其进行挑战，然后使用生物添加剂涂层的密封塑料本身进行真空密封，或将其夹在具有生物添加剂涂层的插入件之间，以防止食源性污染（图7C）。如图7B中所示，在包装涂层中最佳剂量的生物添加剂时，大肠杆菌的生存力降低至零（无菌落）。

图7B.琼脂平板显示大肠杆菌的生长，并被壳聚糖和 AMP-7组合抑制生长。

市场拓展的其他案例包括推出有助于解决日益增长的全球医疗保健问题：抗生素抗药性的产品。不仅需要安全有效的抗菌剂（例如上述基于生物的药剂），而且还需要对抗抗生素耐药性转移的方法（当细胞裂解时，DNA溢出并可以被其他细胞吸收）。

图7C. 食品包装测试系统示意图。

目前已经成功创建了酶促涂层表面，在被其他细胞吸收之前可以降解并破坏从细胞中溢出的无细胞DNA。

图8左上方的测试板显示出了AMP-7（总固形物的3％）对大肠杆菌的有效杀灭，将其放置在受污染的琼脂平板上时，与对照相比，AMP-7聚氨酯切口边缘周围缺乏细菌菌落的生长指征。图8中间的测试板显示了含有核酸酶DNaseI（总固体含量1.5％）的聚氨酯涂层对DNA的破坏。此处使用的DNA带有对氨苄西林（一种与青霉素有关的β-内酰胺抗生素）具有抗性的基因。暴露后，将DNA从涂层表面重悬并进行分析。在图8中间图的两端的条带分别是每个涂层控制的三个涌（基材本身或聚氨酯涂层）。中间的条带是DNA暴露在含核酸酶的涂层中的涌。当暴露于含核酸酶的涂层表面时，尽管可以看到较小分解产物的涂片，不再检测到明显的条带，表明DNA已被破坏。

图8. 抗菌活性和使用AMP-7 /核酸酶涂层消除大肠杆菌对游离质粒DNA 吸收。

此外，在图8的右侧，证明了在含有DNA的氨苄青霉素抗性基因暴露于核酸酶包被的表面之后，没有发生抗生素抗性向大肠杆菌的转移。此图像中的琼脂板添加了氨苄青霉素，只有能够直接从表面提取DNA的大肠杆菌才能生长（n=3：36、37和26个菌落）。但是，由于DNA被破坏，来自核酸酶涂层表面的大肠杆菌对氨苄青霉素没有产生抗药性，导致没有菌落生长（n=3：0、0和0菌落）。图8的底部总结了整个过程。在细菌被AMP-7裂解并杀死后，游离DNA被被膜中的核酸酶降解，并且抗性基因未通过。

进一步的涂料制造应用以降低杀菌剂水平

在涂料制造领域，这些技术可进一步扩大应用范围和市场领域，如外科手术式打击般通过在涂层制造工艺流程中加入选定的生物添加剂，以减少在最终产品中掺入高含量杀菌剂的需求（图9A）。通过使用前面提到的分子方法，可以快速识别源污染物，并在污染点用生物添加剂对设备线和材料进行相应处理。通过利用酶等生物分子和AMPs的可调性，这些试剂在植物中的靶向使用成为可能。

图9A. 精确使用生物添加剂来控制微生物涂料的腐败，在生产过程中确定污染点。

如图9B所示，通过用生物添加剂保护剂覆盖罐本身，这种保护可能会从工厂一直持续到消费手中，而无需罐内添加杀菌剂。罐壁和油漆/顶空界面处更容易接触到氧气，使微生物得以生长，盖子上的冷凝物堆积使这里成为另一个潜在的问题部位。

图9B. 在容器上涂涂料以抑制所添加产品中的微生物生长。

结论

总而言之，鉴于传统杀菌剂使用所面临的日益严峻的监管挑战，需要采取其他措